干货|了解这些,养好细胞不是事儿!!!

2019-09-25

  抗体药物是目前生物技术药物研究中最为活跃的领域,特别是在肿瘤和自身免疫性疾病等方面的临床应用,更是大放异彩。随着临床需求的增加,单克隆抗体药物发展迅速,FDA已批准的抗体药物多达70多个,抗体药物销售量年增长率基本在10%以上,大大高于制药行业平均水平,其市场规模已经达到千亿美元。

  我国针对单克隆抗体药物的研究与开发也是如火如荼,行业内竞争异常激烈。据统计我国生物类似药研发占全球在研类似药总数的36%。目前,我国约有600家企业在抗体药物领域布局,约有200家企业已提交抗体药物临床试验申请,且靶点比较集中,以TNF-α、EGFR、VEGF、HER2为主。其中,研发和申报比较靠前的企业有齐鲁制药、信达生物、复宏汉霖以及嘉和生物等。

  高速增长的抗体药物正在改变包括癌症在内的多种疑难疾病的治疗观念,因此如何提高哺乳动物细胞生产治疗性抗体的产量和质量便越来越受到重视。

  真人棋牌手机游戏细胞培养是单克隆抗体药物生产的关键环节,直接影响到单抗的产量和质量。细胞培养过程的不稳定,一方面使得不同批次细胞培养的最终抗体产量和质量不一致,影响抗体药物的安全性;另一方面,增加细胞培养过程失败的可能性,产生巨大的资源浪费,降低企业生产的经济效益。

  用于分泌单克隆抗体的哺乳动物细胞培养条件比较苛刻,细胞外环境的变化容易对抗体的结构产生直接的影响,进而影响单抗药物的有效性和安全性。因此,比较理想的细胞培养体系需满足以下几个条件:1、高产率、低成本的细胞系;2、能够得到较高产量和合格质量的培养基和培养罐条件;3、适于过程控制的在线或离线分析技术;4、对不同规模的细胞培养过程有充分的理解,保证规模放大的效果。

  在用于单克隆抗体药物生产的细胞培养过程中,影响抗体生产的稳定性主要是以下几个方面:在工艺参数优化过程中,对细胞培养过程各个参数控制仍存在不足,难以保证过程性能一致性;对不同规模细胞培养过程中,不同规模的培养条件也有所区别,难以实现规模放大。针对细胞培养生产单克隆抗体中存在的难题,引入新的研究思路,增加细胞培养过程的理解,优化生产工艺,提高单抗药物的产率,保证批次间和不同规模下过程性能的一致,降低生产成本,已成为提高生产企业竞争力的重要途径。

  细胞培养过程中主要性能参数

  在细胞培养过程中,通常将活细胞密度(viable cell density,VCD)、细胞活率(viability)、细胞单位生产率(specific productviy,Qp)、糖基化等内容作为细胞培养过程中的性能指标。

  活细胞密度是指细胞生长过程中某个时间点内单位体积内活细胞的数目,也可以直接以活细胞数目(viable cell,VC)表达,通过比较不同时间点的活细胞密度了解培养罐中细胞的生长和增殖情况,对单抗生产至关重要。

  细胞活率是某个时间点培养罐的单位体积内活细胞数目占所有细胞数目的比例。在细胞培养的前期,细胞活率普遍较高,随着细胞凋亡期的到来,细胞活率逐渐降低,合适的环境和培养方式能够使细胞在培养后期保持相对较高的活率。通过流加培养结合培养基优化的方式,提高了细胞培养后期的细胞活率,使细胞培养过程中细胞活率均保持在80%以上,实现了CHO细胞目标蛋白产率的最大化。上述细胞密度及活率的检测中可以使用贝克曼Vi-CELL XR细胞计数和活率检测系统,在细胞培养工艺监测过程中,确保抗体关键质量属性及表达量、胞密度、活性等主要指标的稳定性,有效的解决了过程中细胞参数的测定。Vi-CELL XR的优势在于,全自动测量,样品不需要前处理,完全解放了人力,测试分析时间快,准确度高,真正为细胞培养过程的调整提供了保障。

  细胞单位生产率(specific productviy,Qp)是指单位细胞单位时间内抗体蛋白的产量,该指标通常在选择细胞系时使用。

  在提高抗体生产的稳定性中,以上指标是细胞培养工艺优化的主要目标。而活细胞密度、细胞活率和细胞单位生产率等都对单抗的终产量有很大的影响。

  细胞培养过程中的主要影响因素

  在细胞培养过程中,除了含有表达载体的宿主细胞和培养基外,培养方式、培养工艺参数、代谢物、理化环境和培养规模等因素都会对过程性能参数产生影响。如图1。

图1 细胞培养过程中的主要影响因素

  2.1 工艺参数的影响

  当宿主细胞和培养基确定后,我们需要在实验室进行小试规模细胞培养工艺参数的摸索与优化,为细胞培养过程放大提供合适的大规模培养条件,保证放大后的大规模细胞培养过程有较好的一致性。通常,细胞培养工艺参数有温度、pH值、溶氧(dissolved oxygen,DO值)、二氧化碳分压(pCO2)和搅拌速率等。

  细胞培养液的初始pH值由培养基中的缓冲盐决定,在细胞培养过程中,pH值容易受到乳酸和NH4+等因素的影响。当pH值超出设定的范围时,通过往培养体系中补加CO2或加入NaHCO3溶液的方式将pH值控制在设定范围。pH值对细胞的生长、代谢、重组蛋白的产出和糖基化都有显著的影响。

  溶氧一般选择在20%-50%的范围内,这样既能保证细胞正常代谢所需,又可以减少因糖酵解受到抑制而产生乳酸,也可以避免因溶氧过高导致对细胞的毒性。有研究发现,50%的溶氧与其它溶氧水平相比,细胞的生长速率没有显著差异,但是过低和过高的溶氧环境中,促红细胞生成素的产率明显低于10%-100%的溶氧环境。相关研究还表明,溶氧对于细胞的代谢、重组蛋白的合成和糖基化修饰也有一定的影响。

  细胞培养液中溶解的CO2同样会影响过程性能参数。研究表明,当细胞培养液中的pCO2大于150mmHg时,细胞的生长就会受到抑制,而且抗体蛋白的产量也会降低。因此,细胞生长过程中产生的CO2需要及时排出,尤其是大规模的细胞培养过程中,要注意减少CO2积累对细胞生长所产生的影响。

  温度也是细胞培养过程的关键工艺参数之一,它对细胞的生长、抗体蛋白的产量和质量具有显著的影响。较低的培养温度有利于提高细胞的单位生产率,减缓细胞的代谢,抑制细胞的生长,维持细胞较高的活率,提高目标蛋白的质量。研究发现,在细胞生长接近稳定期时降低培养温度,可以降低抗体蛋白中N-羟乙酰神经氨酸的含量。

  2.2 细胞培养过程中理化参数的影响

  细胞所处的理化环境往往随着培养时间的变化而变化,它们对细胞的生长和抗体蛋白的合成具有极其重要的影响。常见的理化环境参数,除了工艺参数设置的pH值和pCO2外,还包括NH4+浓度、Na+浓度、K+浓度和渗透压(Osmolality,Osm)。有研究发现,当培养体系中NH4Cl的浓度大于5mM时,细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的消耗增加,丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸的合成增多,这种情况下细胞活率会受到抑制,其结果是细胞培养前期的抗体蛋白产率增加,抗体蛋白的糖基化受到影响。细胞膜内外的Na+和K+浓度与跨膜转运、能量代谢等作用密切相关,在细胞的生长、蛋白的合成分泌中发挥着重要的作用。高滲透压能够对细胞生长产生抑制,pCO2会影响细胞的代谢,并最终影响抗体蛋白的产率。上述理化参数可以使用生化分析仪取样离线检测,对这些参数的分析有助于增加细胞培养过程性能参数的监测。

  2.3 细胞培养过程中代谢产物的影响

  细胞所处的外环境不仅包括培养基和外界控制的理化条件,也包括细胞自身代谢物所形成的环境。常见的细胞代谢物主要分为营养成分和代谢中间产物,它们对细胞的生长、增殖和抗体蛋白的分泌有重要影响。对于细胞培养过程中代谢物的研究,有助于了解细胞不同培养时期的代谢状态。

  现阶段的细胞培养都使用无血清成分的CD培养基,无血清培养基成分相对明确,一般含有葡萄糖、氨基酸、维生素、脂质、核苷和生长因子等营养成分。葡萄糖是细胞培养过程中常见的碳源,而谷氨酰胺和天冬酰胺是细胞生长的氮源。在细胞培养过程中,需要对葡萄糖和谷氨酰胺的浓度进行监测,减少因细胞营养成分不足引起的细胞生长障碍。葡萄糖通过糖酵解代谢生成乳酸,葡萄糖的消耗同时也是乳酸积累的过程,乳酸直接影响pH值,并影响细胞的代谢,乳酸在稳定期的生成速率会有所降低。细胞培养过程中,通过流加葡萄糖和半乳糖同样可以提高细胞密度和抗体蛋白的产率。

  氨基酸是蛋白质组成的基本单位,对细胞的生长和蛋白的合成有着重要的影响。采用不同的细胞系或是改变细胞培养的工艺参数,各氨基酸的代谢能力也随之变化。针对消耗较快的氨基酸,给予适时的补给,有利于保证细胞的正常生长和提高目标蛋白的产率。有实验通过增加培养基中含量有限的蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸,减少过多的丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸的方式,不仅获得了更高的活细胞密度,同时提高了目标蛋白的产量。维生素对于维持细胞的正常生理状态起着不可替代的作用,它是形成酶的辅基或辅酶的重要原料。在培养基中加入不同类别的维生素,可以提高活细胞密度,同时增加部分氨基酸的含量,能够显著提高抗体蛋白的产量。

  苹果酸、酮戊二酸和延胡索酸等是细胞三羧酸循环(TCA)的中间产物,这些三羧酸中间产物随着细胞培养时间的增加,它们在培养基中的浓度逐渐增加。研究发现,乳酸代谢的变化会影响TCA循环的进行,进而影响细胞ATP的供应,这些代谢活动的改变使过程性能参数产生了显著的差异。核苷类成分是细胞生长增殖的主要原料,次黄嘌呤和胸腺嘧啶在培养初期加入培养基能够剌激细胞的生长速度,提高单克隆抗体的产量。监测这些代谢物在细胞培养工艺参数改变时的变化特征,揭示它们与过程性能参数之间的联系有利于实现过程的调控,保证细胞培养过程的一致性。

  2.4 细胞培养规模的影响

  在小试规模完成工艺参数优化后,通常需要工艺放大至中试规模或生产规模,以获得临床前单抗、临床研究单抗及商业化生产单抗等进行后续研究或销售。在工艺放大过程中,需要确保产品产量及关键质量属性不会发生显著变化。所以大规模细胞培养的困难在于氧传递的限制、副产物的累积、细胞对剪切力的反应以及更为完善的过程控制等。研究表明,在2000L的细胞培养体系里,pH和溶氧会呈梯度变化。因此,在大规模细胞培养的研究中,需要重点关注氧传递、pH变化和CO2的去除等培养条件的优化。

  有科学家利用代谢组学发现不同的培养规模下,细胞的代谢活动是存在差异的。因此,有理由认为不同培养规模下,细胞培养的理化条件和代谢活动是存在差异的。而了解不同规模下与过程性能参数相关的理化条件差异、代谢差异,有助于细胞大规模培养的成功,保证抗体蛋白产量及关键质量属性的一致性。

  以往的研究主要采用单因素数据分析法来比较不同规模细胞培养过程中常见理化条件参数、代谢指标与过程性能的相关性。但是,在细胞培养过程中,理化条件和代谢活动之间是相互影响的,理化环境的改变会引起细胞代谢的变化,细胞代谢的变化同样对理化环境产生影响,并最终影响过程性能。因而,需要整合细胞培养过程中采集的理化环境参数、代谢物含量和过程性能数据,对不同规模下这三者之间的关系进行研究与比较,增加对细胞培养放大过程的理解,为细胞培养过程控制策略的开发提供参考。

  目前,很少有针对大规模细胞培养生产抗体过程产量稳定的报道,而保证细胞培养不同批次间抗体产量的稳定,不仅能够保证实验数据的可靠性与可重复性,而且能够满足抗体生产过程对工艺稳定性的要求,对于保证药品生产的安全性及企业的经济效益具有重要作用。

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